LAS ENZIMAS Y LAS COENZIMAS.

En un organismo vivo tienen lugar numerosas reacciones químicas, la mayoría de las cuales se encuentran funcionalmente interconectadas, constituyendo un sistema ordenado, intrínseco a la materia viva. Muchas de tales reacciones no pueden llevarse a cabo en las condiciones de pH y temperatura fisiológicos, por lo que necesitan de la presencia de catalizadores específicos de naturaleza proteica: las enzimas. Éstas controlan la naturaleza de la reacción y la velocidad a la que se aproxima el equilibrio, intervienen tanto en reacciones que requieren energía para llevarse a cabo (reacciones endorgónicas), como en las que desprenden energía (reacciones exorgónicas). El acoplamiento de dichas reacciones permite al organismo alcanzar una compleja armonía en la que, a pesar de su continua transformación, mantiene una composición constante, es decir, un estado estacionario. Las enzimas no difieren en cuanto a composición de aminoácidos del resto de proteínas, a su vez, su acción catalítica depende de la formación de enlaces o de interacciones moleculares semejantes a las establecidas en las reacciones orgánicas ordinarias entre aminoácidos y grupos prostéticos, por ello el estudio de las enzimas no es sino un caso particular del de las proteínas.

enzimaExisten dos aspectos de la acción catalítica de las enzimas que conviene destacar: al final de la reacción, la enzima mantiene su configuración inicial y no modifica la constante de equilibrio de una reacción, ni las características termo dinámicas del sistema, sino que hace que la reacción se aproxime más rápidamente al equilibrio; digamos en consecuencia que sí afecta a la velocidad de reacción. La de una reacción se define como la cantidad de material inicial, sustrato (transformado), o como la cantidad de compuesto final (producto), formado por unidad de tiempo. En una secuencia de reacciones, el producto de una de ellas puede constituir el sustrato de la siguiente, de forma que producto y sustrato llegan a confundirse y reciben el nombre de metabolitos intermedios. La enzima actúa como catalizador de la reacción induciendo un aumento de su velocidad, ello ocurre por interacción entre sustrato y enzima; en primer lugar el sustrato se une temporalmente a la enzima en el denominado sitio de unión del sustrato, constituido  por unos cuantos aminoácidos, así se consigue la aproximación que permite a los aminoácidos enzimáticos involucrados directamente en el proceso catalítico y localizados en el sitio catalítico, interactuar con el sustrato en el lugar que va a ser transformado. La unión de la enzima con el sustrato puede ser covalente y suponer un cambio en la propia configuración estructural de la enzima, pero al final del proceso, cuando el producto de la reacción es liberado, la enzima recupera su forma original y puede actuar sobre una nueva molécula de sustrato. El o los sitios de unión al sustrato y el sitio catalítico de la enzima constituyen en conjunto el denominado sitio activo al que cabría definir como un conjunto de cadenas laterales de aminoácidos de la molécula de enzima que interactúan con el sustrato, tanto en cuanto a su reconocimiento y unión como en cuanto a su transformación.

Los aminoácidos que constituyen el sitio activo de una enzima no tienen que estar necesariamente contiguos en su estructura primaria, de hecho aminoácidos muy distantes en la secuencia proteica pueden formar parte del sitio activo de la enzima en ciernes, se dan casos en los que el sitio de unión del sustrato y el sitio catalítico coinciden, pero en otros, los dos sitios están formados por dominios diferentes, incluso distantes en la molécula de proteína. Conviene definir otros conceptos relacionados con la acción enzimática:

Apoenzima: Se refiere sólo a la parte proteica de la enzima, independientemente de cualquier otro grupo o componente necesario para que la enzima sea funcionalmente activa; suele carece de actividad catalítica.

Cofactores: Son moléculas orgánicas o inorgánicas de pequeño tamaño (por ejemplo, un ión metálico), cuya presencia es necesaria para que la enzima sea activa.

Grupo prostético: Componente no proteico unido fuertemente a la apoenzima, es frecuente la confusión entre grupo prostético y cofactor, la diferencia radica en la fuerza de su unión a la enzima. Cuando el grupo prostético es de naturaleza orgánica recibe el nombre de coenzima, y su asociación a la apoenzima da lugar a la holoenzima, que no es  más que la enzima activa. Normalmente al referirse a la enzima se está dirigiendo el concepto semántico a la holoenzima, sin especificar la naturaleza del grupo prostético. En algunas enzimas existe un tercer sitio, distinto del sitio activo o de de unión del sustrato, denominado sitio alostérico, donde se unen moléculas pequeñas. Los efectores alostéricos, los cuales modifican la configuración espacial de la enzima, son las enzimas alostéricas en las que el cambio configuracional inducido por el efector altera la actividad del sitio activo y, en consecuencia si eficiencia catalítica. Son enzimas con características funcionales y estructurales muy particulares que poseen un importante papel en el control metabólico.

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COENZIMAS.

Muchas enzimas sólo catalizan la transformación del sustrato en presencia de una coenzima, molécula de naturaleza orgánica, de bajo peso molecular, más estable que la enzima a temperaturas elevadas, y que participa junto con aquella en el proceso catalítico de dos maneras posibles: a veces la coenzima tiene una afinidad por la enzima similar a la del sustrato, y de hecho, puede considerarse como un segundo sustrato (o cosustrato) de la reacción catalizada por la enzima; mientras que en otros casos, la coenzima se encuentra unida covalentemente a la enzima en su sitio activo o en un lugar próximo a él, y participa activamente en el proceso catalítico. Cuando la coenzima actúa como cosustrato, los cambios químicos que acontecen en ella son exactamente los opuestos a los que tienen lugar en el sustrato, así por ejemplo en reacciones de óxido-reducción, mientras el sustrato es oxidado, la coenzima es reducida, o viceversa. Este es el caso de la oxidación del lactato por la lactato deshidrogenasa en la que el NAD+ (coenzima) actúa como cosustrato de la reacción:

CH3-CHOH-COO+ NAD+ que da lugar a CH3-CO-COO + H+ resultando la reacción igualmente reversible.

En este ejemplo la coenzima actúa como aceptor de hidrogeniones, pero puede actuar como aceptor de otros grupos moleculares en otro tipo de reacciones, por lo que cabe generalizar el proceso de la siguiente forma:

D-G + CoE = CoE-G +D

Donde D es la molécula donadora del grupo (G), y CoE, la coenzima.

Se dan también casos en que la coenzima participa como un transportador intermediario en un sistema de reacciones, facilitando la transferencia del grupo correspondiente a un aceptor. Un ejemplo de este tipo de reacciones es el catalizado por las transaminasas en que el fosfato de piridoxal (coenzima) participa en la transferencia del grupo amino de un aminoácido a un a-cetoácido ( 2-oxoácido).

Todas las coenzimas son vitaminas hidrosolubles, cuyos aspectos estructurales y funcionales permiten considerarlas como un segundo sustrato de la reacción.

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SITIO CATALÍTICO Y ESPECIFIDAD.

La efectividad de la acción catalítica de una enzima radica en la capacidad de su estructura proteica para moldearse, lo que es posible de formas muy diversas. En la molécula enzimática existen hendiduras que constituyen los sitios activos a través de los cuales difunden otras moléculas. Cuando una de estas moléculas (sustrato) reúne las características necesarias para su acoplamiento con la correspondiente hendidura (lugar de unión al sustrato), la proteína se cierra y coloca una serie de grupos químicos (cadenas laterales de los aminoácidos que constituyen el sitio catalítico) en la disposición geométrica adecuada para facilitar su interacción fisicoquímica (acción catalítica). Así pues, la unión del sustrato al sitio correspondiente de la molécula de enzima, desempeña un papel fundamental en la especificidad enzimática, ya que las cadenas laterales de los aminoácidos que constituyen dicho sitio sólo permiten el acoplamiento de compuestos con determinadas características estructurales. La necesidad de esta interacción enzima-sustrato determina que una enzima sea capaz de catalizar únicamente la reacción de unos pocos sustratos, e incluso de una solo; o en otros términos, sólo determinados compuestos pueden actuar como sustratos de una enzima. Esta especificidad es una característica fundamental de los sistemas biológicos, y constituye la clave para su control, de hecho, los cambios en la actividad de una enzima afectan a determinados compuestos o vías metabólicas, pero no a otros. La especificidad enzimática puede referirse exclusivamente a la naturaleza del sustrato, en cuyo caso depende de la unión, enzima- sustrato (E-S), en  este caso la enzima diferencia un compuesto de su isómero y en otros casos la enzima diferencia un compuesto de otro con características estructurales muy semejantes. Existe también la especificidad de función, que se refiere a que un mismo compuesto puede ser sustrato de varias enzimas, que lo modifican de distinta forma. En este caso la especificidad, no depende de la unión E-S sino de la acción catalítica de la enzima, es decir de la interacción del sitio catalítico con el sustrato.

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MECANISMO DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA.

El primer modelo de la acción catalítica de una enzima fue propuesto por Emil Fischer en 1894, quién consideró que se trataba de una interacción similar a la de una llave con su cerradura, en la actualidad este modelo está descartado ya que  supone una rigidez en el acoplamiento de la enzima con su sustrato, que no es compatible con la estructura flexible de las proteínas, a pesar de ello, el modelo de la llave cerradura es aún útil para comprender algunas propiedades de las enzimas, tales como la unión secuencial de más de un sustrato o la cinética de saturación de la enzima frente a un sustrato. En 1963, Koshland, propuso una modificación del modelo de Fischer, denominado modelo del ajuste inducido, que fue recibido al principio con cierto escepticismo, pero que en la actualidad es ampliamente reconocido por contar con bastante apoyo experimental. Este modelo implica la flexibilidad del sitio del sitio catalítico, de forma que el sustrato produce un cambio conformacional de la enzima. Dicho cambio permite que las cadenas laterales de determinados aminoácidos o de otros grupos de la molécula enzimática, o de los dos, adquieran la orientación espacial adecuada para la unión del sustrato, para llevar a cabo el proceso catalítico o para ambos procesos. Las cadenas hidrofóbicas de aminoácidos ácidos del tipo de la fenilamina (Phe), y los grupos cargados de los aminoácidos ácidos (Asp), participan en la unión del sustrato a la enzima, mientras que el grupo fosfórico de una fosfo-serina (p-Ser) y el hidróxido de una treonina (Thr) participan en una acción catalítica. En ausencia de sustrato, los radicales de unión del sustrato y del sitio catalítico se encuentran distantes entre sí, cuando aquél se aproxima a la enzima, induce un cambio conformacional en su estructura proteica, de modo que dichos radicales se colocan de la forma apropiada para permitir la unión del sustrato y la aproximación a éste de aminoácidos del sitio catalítico para llevar a cabo su función, estos cambios espaciales modifican incluso la orientación de otras regiones de la molécula, y de ahí que dos aminoácidos que se encontraban distantes, lisina y metionina, se aproximen cuando el sustrato está unido a la enzima. La secuencia de acontecimientos que tienen lugar en el ajuste inducido, permite comprender también porqué compuestos análogos al sustrato pueden causar algunos cambios conformacionales en la enzima e incluso ocupar o modificar los sitios de unión del sustrato, impidiendo la acción catalítica de la enzima.

Las cadenas laterales de muchos aminoácidos proteicos constituyen factores catalíticos en las reacciones orgánicas ordinarias. A través del mismo mecanismo, dichos aminoácidos participan en la acción catalítica de las enzimas, este es el caso de los aminoácidos cuyas cadenas laterales pueden ceder o aceptar protones como son los radicales de histidina, lisina y ácido glutámico y ácido aspártico, que actúan de forma reversible como ácidos, capaces de ceder protones o como bases capaces de aceptar los mismos. Los radicales de otros aminoácidos pueden ceder electrones a grupos cuyos orbitales no están llenos, actuando como nucleófilos caso de los aminoácidos con grupos hidróxilo o amino. La efectividad catalítica de las enzimas depende tanto de la capacidad de unión específica con el sustrato como de presencia de grupos catalíticos. En una reacción ordinaria, un compuesto debe alcanzar una configuración energéticamente desfavorable para ser transformado, en otras palabras: un compuesto con un determinado nivel energético en estado inicial, debe alcanzar un nivel energético más alto en el estado de transición para ser transformado en un producto, con su valor energético final o estado final que normalmente es inferior al inicial. La formación del estado de transición representa una barrera energética o energía de actuación que debe ser aportada por el entorno para que la reacción tenga lugar. En la práctica, la energía de activación de las reacciones ordinarias se obtiene de un incremento de la temperatura o de un cambio de pH, entre otros factores. En presencia de las enzimas, esta situación varía completamente, la unión de la enzima con el sustrato alcanza la mayor estabilidad cuando este último se encuentra en una forma intermedia de alta energía; por consiguiente, la unión enzima sustrato E-S llega a constituir el estado de transición, favoreciendo así que la reacción tenga lugar, sin necesidad de un aporte energético ambiental. La energía de activación necesaria para alcanzar dicho estado de transición es, por tanto, inferior a la que se requeriría en caso de que no hubiera tenido lugar dicha unión enzima-sustrato. El complejo E-S tiene que atravesar una serie de barreras energéticas que no son otra cosa que cambios conformacionales de la enzima a medida que tiene lugar su acción catalítica, la propia formación del producto y la adaptación de la enzima al mismo para su posterior difusión al medio conlleva la formación de un estado energético de transición. Cualquier reacción enzimática se lleva a cabo por lo menos, a través de cinco etapas consecutivas:

  1. Reconocimiento de la enzima.
  2. Formación del complejo enzima-sustrato.
  3. Transformación de este complejo en un complejo intermedio de transición en el que se favorece la acción catalítica de la enzima.
  4. Formación de la enzima producto (E-P).
  5. Disociación de este complejo en enzima y producto.

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CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS.

Hasta hace unos quince años, el nombre de las enzimas era establecido por su descubridor, y a veces era modificado posteriormente por otros investigadores. No existía más norma que el sufijo asa precedido del nombre del órgano de donde se había aislado; por ejemplo del páncreas origen del sustrato : proteasa, por actuar sobre proteínas, del tipo de reacción catalizada: hidrolasa, por catalizar la hidrólisis del sustrato, o del nombre del producto formado en la reacción catalizada por la enzima. Se llegó incluso a añadir el sufijo asa  a nombres de fenómenos que no eran necesariamente catalizados por enzimas individuales (permeasa, replicasa, translocasa, reparasa, etc). Para evitar esta confusión, en 1956, la Unión Internacional de Bioquímica (IUB, International Union of Biochemistry) estableció un comité de Nomenclatura que ha desarrollado un sistema de nomenclatura para todas las enzimas. Esta ha tardado en ser admitida universalmente, dado que estaba muy establecida la denominación común y trivial de muchas enzimas. Ello ha obligado a dicho Comité a revisar varias veces su propuesta; sus últimas recomendaciones se han publicado en 1984, y en ellas, al mismo tiempo que una clasificación sistemática de las enzimas, recomienda la utilización de un determinado nombre común, siempre que ello sea posible. La IUB ha establecido un sistema por el cual todas las enzimas se clasifican en seis clases, cada una de ellas se subdivide en subclases y éstas, a su vez en sub-subclases. Cada clase, subclase y sub-subclase tiene asignado un número, y dentro de la última categoría, a cada enzima se le asigna también un número , de esta forma, todas las enzimas se identifican por un número de cuatro dígitos, así como  con un nombre sistemático que consta del nombre del (los) sustrato (s), seguido del tipo de reacción terminado en asa. Así pues, cuatro dígitos corresponden a una enzima determinada y su nombre sistemático permite identificar la reacción que cataliza.

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Clases y subclases de enzimas reconocidas por la IUB:

1.- Oxido-reductasa: Catalizan reacciones de óxido-reducción entre dos sustratos, S y S/: el sustrato que se oxida es un donador de hidrogeniones, el nombre sistemático de esta clase de enzimas se construye como donador-aceptor óxido-reductasa o de deshidrogenasas, alguna vez se denominan oxidasas solo en el caso en que el aceptor es el oxígeno molecular. Estas enzimas catalizan las óxido-reducciones de grupos moleculares como éstos: C=O, CH-NH2, CH-CH, CH-OH, y CH=NHY y en función de estos grupos se establecen las correspondientes subclases:

Actúan sobre grupos CH-OH como donadores de electrones.

Actúan sobre grupos aldehído u oxo como donadores de electrones.

Actúan sobre grupos CH-CH como donadores de electrones.

Actúan sobre grupos CH-NH2 como donadores.

Actúan sobre grupos CH-NH como donadores.

Actúan sobre grupos NADH o NADPH como donadores.

Actúan sobre compuestos nitrogenados como donadores.

Actúan sobre  grupos sulfurados como donadores.

Actúan sobre grupos hemo como donadores.

Actúan sobre grupos difenoles y sustancias relacionadas como donadores.

Actúan sobre peróxido de hidrógeno como aceptor de electrones.

Actúan sobre hidrógeno como donador de electrones.

Actúan sobre donadores sencillos, con incorporación de oxígeno  molecular con lo cual también se llaman oxigenasas.

Actúan sobre pares de donadores de electrones con incorporación de oxígeno Molecular.

Actúan sobre radicales superóxidos como aceptores de electrones.

Actúan como oxidantes de iones metálicos.

Actúan sobre grupos –CH2-.

Actúan sobre ferredoxina reducida como donadora de electrones.

Actúan sobre flavodoxina reducida como donadora de electrones.

Subclase formada por otras óxido-reductasas no incluidas en las anteriores.

Ejemplos de esta clase de enzimas son:

Glicerol: NAD+ oxireductasa(glicerol deshidrogenasa), cataliza la siguiente reacción:  Glicerol+NAD+= dihidroxiacetona+NADH

L-Glutamato: NAD+ óxido-reductasa(glutamato deshidrogenasa): L-glutamato+H2O+NAD+=2-oxoglutamato+NH3+NADH

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Clase 2.- Transferasas. Son enzimas que transfieren un grupo (G) diferente del hidrógeno de un sustrato(S) a otro (S/):

S-G+S/=S+S/-G

Los grupos transferidos son muy diversos y, de acuerdo con ellos, se han establecido las correspondientes subclases:

Transfieren grupos de un carbono.

Transfieren residuos de aldehídos o cetonas.

Transfieren grupos ácilos (trasnferasas).

Transfieren grupos  glucosilicos (glucosil-transferasas).

Transfieren grupos alquilo o arilos.

Transfieren grupos nitrogenados.

Transfieren grupos que contienen fósforo.

Transfieren grupos que contienen azufre.

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Son ejemplos de esta clase de enzimas:

Acetil-CoA:Carmitina O-acetil transferasa(carmitina acetil transferasa):

Acetil-CoA+carmitina=CoA+O-acetilcarmitina

ATP: D-hexosa 6-fosfotransferasa hexoquinasa): ATP+D-hexosa=ADP+D-hexosa-6-fosfato.

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Clase 3. Hidrolasas. Estas enzimas catalizan la ruptura hidrolítica de uniones tales como C-C, C-N, C-O, anhídridos fosfóricos, etc:

A-B+H2O=A-H+B-OH

Las subclases de las hidrolasas son:

Actúan sobre enlaces esteres.

Glucosidasas que hidrolizan enlaces glucosidicos.

Actúan sobre enlaces éter.

Actúan sobre enlaces peptidicos o péptidos hidrolasas.

Actúan sobre enlaces C-N distintos de los péptidos.

Actúan sobre anhídridos de ácidos.

Actúan sobre enlaces C-C.

Actúan sobre enlaces haluros.

Actúan sobre enlaces P-N.

Actúan sobre enlaces S-N.

Actúan sobre enlaces C-N.

Actúan sobre enlaces C-P.

Como ejemplos de esta clase tenemos:

Acilcolina acihidrolasa(colinesterasa): Acil-colina+H2O=colina+ácido carboxílico.

L-a-aspartil(L-a-glutamil)-péptido hidrolasa(aminopéptidasa-A): Péptido L-a-aspartilico+H2O=L-aspartato + péptido.

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Clase 4.- Liasas. Son enzimas que catalizan la liberación de grupos de los enlaces C-C, C-O. C-N o similares del sustrato, dando lugar a la formación de dobles enlaces, sin la participación de hidrolisis u oxidación, de forma inversa también catalizan la inclusión de grupos a los dobles enlaces:

CX-CY=X-Y+C=C, A-B=A+B o D-E+H-I=DH-EI

Las subclases son:

Liasas de enlaces C-C.

Liasas de enlaces C-O.

Liasas de enlaces C-N.

Liasas de enlaces C-S.

Liasas de enlaces C-Halueo.

Liasas de enlaces p-o.

Otras liasas no incluidas en las anteriores subclases.

Como ejemplos de esta clase tenemos:

Malato hidroliasa (fumarato hidroliasa o fumarasa).

Malato=fumarato+H2O

S-adenosil-L-metionina metilioadenosina(I-aminociclopropano-I-carboxilato sintasa): S-adenosil-L-metionina=I-aminociclopropano-I-carboxilato+metilioadenosin.

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Clase 5.- Isomerasas. Estas enzimas catalizan cambios geométricos, ópticos o estructurales (isómeros de posición) de una molécula, de acuerdo con el tipo de isomería que catalizan, pueden denominarse racemasas, epimerasas, cis-trans-isomerasas, tautomerasas, mutasas, o ciclo-isomerasas, las subclases son:

Racemasas y epimerasas.

Cis-trans-isomerasas.

Oxidoreductasas intramoleculares.

Transferasas intramoleculares.

Liasas intramoleculares.

Otras isomerasas(subclase de miscelánea).

Ejemplos:

Aspartato racemasa que cataliza la transformación: L-aspartato=D-aspartato

Maleato-cis-isomerasa: Maleato= fumarato

B-L-glucosa-1,6-fosfomutasa (B-fosfoglucomutasa): B-D-glucosa-1-fosfato=B-D-glucosa-6-fosfato

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Clase 6. Ligasas. Catalizan la unión de dos moléculas, acoplada a la hidrólisis de un enlace pirofosfato perteneciente a una molécula de ATP o a un compuesto similar.

Normalmente en el proceso se forma o se hidroliza un enlace rico en energía, en esta clase se incluyen las denominadas sinteasas, pero en muchos casos este nombre ha sido mal aplicado a enzimas que catalizan reacciones distintas de las ligasas, como son las de síntesis que no conllevan hidrólisis de un enlace fosfórico rico en energía(glucógeno sinteasa). Para evitar esta confusión, a dichas enzimas se les conoce con el nombre de sintasas. El tema es aún confuso, ya que aunque en la nomenclatura  de la IUB, la mayoría de las sintasas se incluyen en la clase 4 (liasas) y las sintetasas en las de la clase de las ligasas, haya algunas, como la propia glucógeno sintasa, que pertenece a la clase 2 o transferasas. Para evitar esta confusión, el Comité de Nomenclatura de la IUB propuso en 1983 reemplazar el uso de sinteasa por el de X-Y ligasa, y en caso de que algún autor continúe con la anterior denominación, ésta debe estar restringida a las enzimas de la clase 6 (ligasas).

En esta clase se incluyen las siguientes subclases:

Forman enlaces C-O

Forman enlaces C-S

Forman enlaces C-N

Forman enlaces-C

Forman enlaces de ésteres fosfóricos

Como ejemplos pueden citarse: L-glutamato: amonio ligasa: ATP+L-glutamato+NH3=ADP+ortofosfato+L-glutamina.

Piruvato: dióxido de carbono ligasa(carboxilasa): Piruvato+ATP+HCO3=ADP+ortofosfato+oxaloacetato.

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ISOENZIMAS.

Muchas enzimas están distribuidas ampliamente entre las distintas células del organismo y, aunque catalizan las mismas reacciones químicas específicas, suelen presentar características físicas, bioquímicas e inmunológicas distintas, dependiendo de su procedencia. De hecho, aunque la estructura del sitio activo de enzimas con la misma especificidad sea igual o muy similar de unas a otras, no son proteínas idénticas, sino que dependiendo de su origen, es probable que la secuencia de aminoácidos de sus fragmentos de sus cadenas peptidicas difieran considerablemente. A estas variantes de enzimas que realizan la misma acción catalítica, pero que presentan diferentes estructuras moleculares dentro de una misma especie, se les denomina isoenzimas o isozimas. En algunos casos, dichas isoenzimas se deben a la modificación  por factores que cambian la carga iónica o la conformación de enzimas codificadas por un mismo gen, dependiendo de la célula de procedencia. No obstante, pueden formarse también a partir de más de un gen, este es el caso por ejemplo de la lactato deshidrogenasa (LDH), que se sintetiza a partir de dos gens individuales distintos que dan lugar a polipéptidos con diferencias estructurales importantes, pero con la misma actividad catalítica. En este caso, la enzima se configura como un tetrámero formado por dos subunidades distintas. Una de estas sub-unidades polipétidicas se encuentran preferentemente en el corazón (la denominada subunidad H, por el nombre inglés del corazón), mientras que la otra  se encuentra en músculo (subunidad M). Sólo la molécula tetramérica de la LDH es activa, y dichas subunidades (protómeros) pueden aparecer combinadas de cinco formas distintas, dependiendo del tejido de que se trate:

HHHH      (LDH-1, o isoenzima del corazón).

HHHM     (LDH-2).

HHMM    (LDH-3).

HMMM   (LDH-4).

MMMM  (LDH-5, o isoenzima del músculo.

Además de su distinta distribución entre los tejidos y sus diferencias estructurales, y aunque las dos subunidades catalizan la reducción reversible del piruvato a lactato, presentan también características funcionales distintas. Así, la LDH-5 (de músculo esquelético) tiene una alta efectividad catalitica sobre el piruvato, favoreciendo, así la conversión del que se produce en la glucólisis anaerobia a lactato. Sin embargo, la LDH-1 es de menos afinidad sobre el mismo sustrato e incluso es inhibida por un exceso de piruvato. De esta forma el músculo cardíaco, que tiene metabolismo aerobio activo cataliza el piruvato formado a partir de glucosa hacia su oxidación completa a CO2 y H2O, en vez de hacia la formación del lactato. Además de su importancia funcional en el metabolismo de determinados tejidos, las isoenzimas son también importantes en el diagnóstico clínico diferencial. Su distribución en tejidos específicos permite diagnosticar el daño de los mismos cuando aparecen en sangre. Precisamente por sus diferencias estructurales y funcionales, resulta fácil identificarlas y analizarlas, al poseer distinta carga, las isoenzimas migran a diferente velocidad en un determinado campo eléctrico, por lo que se separan con facilidad por electroforesis, asimismo pueden identificarse por su diferente estabilidad al calor, resistencia a agentes químicos o afinidad a los sustrato, las coenzimas o a ambos.

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CINÉTICA ENZIMÁTICA.

La cinética de una reacción química estudia la velocidad del cambio del estado inicial de los reactantes y productos a su estado final, y los factores que la modifican. Dado que las enzimas afectan la velocidad de las reacciones químicas, la aplicación de los principios básicos de la cinética a las reacciones catalizadas por enzimas constituye la cinética enzimática. La velocidad de una reacción puede definirse como el cambio de la concentración de sustrato o de producto por unidad de tiempo, mientras que la tasa es el cambio cuantitativo total (moléculas o gramos) por unidad de tiempo.

Hay muchos factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática puede definirse; entre ellos cabe destacar los siguientes: la concentración de la enzima, la del sustrato, la del complejo enzima-sustrato, la del producto y la de los activadores e inhibidores, la fuerza iónica del medio, el pH y la temperatura. Para estudiar la cinética de una enzima, los distintos componentes de la reacción se añaden a un recipiente (cubeta de reacción) en cantidad suficiente, y se establecen las condiciones óptimas de temperatura (mediante termostato) y de pH (mediante la adición de una solución amortiguadora), sin embargo, el factor que se desea estudiar se mantiene como variable, y los cambios en el mismo repercutirán en la velocidad de reacción. De esta forma es posible conocer  en qué medida dicho factor afecta dicho a la reacción y establecer las correspondientes relaciones. Por ejemplo, si se quiere determinar la actividad catalítica de una enzima, se ponen en la cubeta de reacción todos los factores que participan en ella (sustrato, cosustrato, coenzima, etc.) en exceso, a excepción de la enzima, la adición de una cierta cantidad de ésta, hará que la reacción se desarrolle a determinada velocidad, que dependerá precisamente de la actividad de la enzima, ya que es el único factor limitante del proceso. De igual forma podemos hallar la concentración de un determinado sustrato en una muestra problema, para ello colocamos la enzima y todos los demás factores en exceso, a excepción del sustrato. La adición del problema a la cubeta de reacción dará una velocidad que es la función de la concentración del sustrato en dicha muestra problema. De esta forma, manteniendo constantes todos los componentes y factores que afectan a la velocidad de reacción, y manteniendo variable el componente o factor que deseamos evaluar, se consigue estudiar los principios de la cinética enzimática y aplicarlos no solo a la bioquímica básica, sino también al diagnóstico clínico y al uso de las enzimas como reactivos insustituibles de laboratorio Debemos asimismo hacer relevancia de la inhibición enzimática consistente en la presencia de ciertas moléculas que pueden disminuir la velocidad de la reacción al interferir con la formación del complejo enzima-sustrato, con su disociación o con ambos procesos, estas moléculas se denominan inhibidores, y afectan la cinética de la reacción de muy diversa manera, existen varios tipos de ellas: inhibición competitiva, no-competitiva y acompetitiva así como un tipo de inhibición particular que en algunos casos llega a ejercer el propio sustrato (inhibición por sustrato).

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ENZIMOLOGÍA CLÍNICA.

El tubo de ensayo es un sistema cerrado en el que las enzimas purificadas utilizan el sustrato que se les ofrece y acumulan el producto de la reacción que catalizan. En el interior de la célula, sin embargo, la disponibilidad de sustrato y cosustratos de una enzima varía en función de diversos factores, que muchas veces son independientes de la propia reacción (captación por la membrana celular, transformación por la acción de otras reacciones enzimáticas, compartimentación intracelular, etc.) Por otro lado, los productos de la reacción no se acumulan en la célula, sino que generalmente son utilizados como sustratos de otra enzima, cuyos productos son a su vez, sustratos de otra, y así sucesivamente hasta que se forman moléculas de gran tamaño (glucógeno, proteínas o lípidos complejos), que se acumulan, o moléculas pequeñas (CO2,agua urea, etc.) que acaban por ser eliminadas al exterior en forma de productos de desecho. Este intercambio continuo de productos intermedios puede presentar ramificaciones; se denomina vía metabólica a la secuencia de reacciones que ocurren entre dos puntos definidos de una rama, en cierta medida, todas las reacciones catalizadas por enzimas son reversibles pero la configuración secuencial de las vías metabólicas hace que en las células vivas el flujo del metabolismo sea irreversible y permanentemente dinámico, ésta es una característica inherente a la vida y de hecho, sólo se consigue el verdadero equilibrio metabólico cuando la célula muere, dicha característica es extrapolable al organismo vivo completo, cuyo metabolismo está constituido por una complicada red de síntesis anabólicas y de degradaciones catabólicas controladas de tal forma que la composición del medio interno permanece fija lográndose el llamado estado estacionario que corresponde al concepto de homeostasis, propuesto por Claude Bernard a finales del siglo pasado. La coordinación del conjunto de las vías metabólicas y de sus relaciones con los factores externos (transporte de metabolitos, temperatura, etc.), es imprescindible para el mantenimiento de la homeostasis, no solo a nivel celular, sino a cualquier otro nivel de organización (tejido, órgano e incluso organismo vivo completo). Deben coordinarse gran diversidad de funciones y en consecuencia no existe un mecanismo único de control. Los organismos poseen mecanismos muy diversos para regular su metabolismo y, en muchos casos, entidades diferentes (especies distintas, órganos, tejidos e incluso células), utilizan distintos procedimientos para controlar determinadas funciones, pero independientemente del nivel de organización, la regulación enzimática desempeña un papel fundamental en el control de todos los procesos metabólicos. La función principal de un laboratorio clínico es investigar y cuantificar analíticamente las alteraciones bioquímicas que existen en el individuo enfermo. Una parte importante de esta función corresponde al ensayo de enzimas en líquidos o fluidos biológicos extracelulares (plasma y suero, orina, jugo gástrico, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y líquido sinovial) y en células sanguíneas. Todas las enzimas se sintetizan intracelularmente, y la mayoría de ellas realizan sus funciones catalíticas dentro de las mismas células donde se han formado, sin embargo, algunas son segregadas en forma inactiva y, después de ser activadas, actúan en el espacio extracelular, éste es el caso de las enzimas del tracto gastrointestinal, algunas de las cuales pasan a la sangre, por ejemplo la amilasa pancreática, de la lipoproteína lipasa del endotelio vascular o de las enzimas que participan en los procesos de coagulación. En analítica clínica tienen especial importancia las enzimas que se encuentran normalmente dentro de las células, y que en condiciones fisiológicas presentan una baja actividad en plasma o en suero. En condiciones patológicas se detectan cambios importantes en las actividades plasmáticas de algunas de ellas, de las que es posible inferir el daño existente en los tejidos corporales de donde proceden. En consecuencia, es importante conocer los factores que determinan la transmisión de ciertas enzimas desde sus lugares de origen al torrente sanguíneo así como el modo en que son eliminadas de aquella, esto permite interpretar correctamente los cambios de su actividad plasmática y relacionarlos con la situación patológica que corresponda. El nivel de una enzima en plasma se pone de manifiesto por su actividad, que resulta del equilibrio entre la velocidad con que sale de la célula o células de origen y la velocidad con que es inactivada en la circulación sanguínea o es eliminada de ella. Los principales factores que intervienen en estos procesos son  los siguientes:

Entrada de enzimas a la circulación por daño en la membrana plasmática.

El factor que afecta en mayor medida a los niveles enzimáticos detectados en plasma o suero es la velocidad de salida de las enzimas a la circulación, que depende a su vez de dos procesos distintos: la salida propiamente dicha de la enzima al exterior celular y los cambios en la producción enzimática que pueden ser por incremento de su síntesis, en determinado tipo de células, o por incremento de la proliferación celular. Las enzimas se encuentran en el interior de las células protegidas por la membrana plasmática, pero existen situaciones por ejemplo, una reducción brusca de las disponibilidades energéticas o factores como un traumatismo, una infección vírica, agentes químicos o incluso la propia muerte celular, que deterioran dicha membrana y permiten la liberación al espacio extracelular de moléculas que en condiciones normales no son capaces de atravesarla, como las enzimas. Un ejemplo de esta situación lo constituye el órgano hepático, cuyas células (hepatocitos) son especialmente sensibles a la hipoxia producida como consecuencia de la disminución del flujo cardíaco, aumentando así el nivel de enzimas hepáticas en sangre. Otro ejemplo lo constituye el músculo esquelético, en el que el escape de enzimas celulares ocurre en situaciones tales como hipotermia, infección, inflamación o cambios degenerativos como distrofias, entre otras. Cabe indicar también que debido a la alta concentración de las enzimas en el interior celular y a la gran sensibilidad con que pueden ser cuantificadas por sus características catalíticas, un incremento de su actividad en plasma constituye un método enormemente sensible para detectar un pequeño daño celular, e incluso a veces para localizar el tejido lesionado.

Cambios en la  producción enzimática.

A pesar de que las enzimas son intracelulares, existe un intercambio permanente de células, muerte de unas, formación de otras y escapes o fugas de enzimas de células sanas, que dan lugar a la continua liberación de pequeñas cantidades de enzimas a la sangre incluso en condiciones de normalidad. Dicha liberación puede estar disminuida por un efecto genético de la síntesis enzimática o por una disminución patológica de su formación, tales disminuciones son poco frecuentes y difíciles de detectar. Se dan también cambios en sentido inverso, es decir incrementos en la producción enzimática, los cuales tienen un mayor interés diagnóstico. Por ejemplo en determinadas enfermedades óseas, el incremento en el número y la actividad de osteoblastos productores de fosfatasa alcalina, da lugar a un aumento de la actividad de esa enzima en suero. Hay situaciones en las que el incremento de la producción enzimática y su consiguiente salida a la circulación es el reflejo directo de la inducción de su síntesis; este es el caso de la elevación en suero de la glutamil transferasa, tras la ingestión de barbitúricos, de alcohol, o el de la producción de fosfatasa alcalina por el hígado tras la obstrucción biliar. En otros casos, la mayor producción de una determinada enzima es el reflejo de la proliferación celular y no el resultado de una mayor síntesis, esto ocurre en los tumores malignos, como el cáncer de próstata, en el que aumenta la actividad plasmática de la isoenzima prostática de la fosfatasa ácida, a pesar de estar disminuida su producción celular.

Aclaramiento o liberación de enzimas de la circulación.

Poco se sabe de la forma en que las enzimas salen de la circulación; además, en la mayoría de los casos su tamaño molecular les impide atravesar el glomérulo renal para ser eliminadas por la orina, hay sin embargo, alguna excepción, como la de la amilasa, cuyo incremento en sangre en la pancreatitis aguda se acompaña de su aparición en orina. Se cree que en la mayoría de los casos las enzimas se eliminan de la circulación a través de las células del sistema retículo endotelial después de ser inactivadas en el propio plasma. La vida media de una enzima puede variar de unas horas a varios días, y lógicamente éste es un factor importante que debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados analíticos correspondientes. Para decidir qué enzima debe medirse en el plasma a efectos de un diagnóstico o pronóstico, deben considerarse varios factores: El primero de ellos es la distribución tisular de las enzimas, ya que su concentración varía de unos tejidos a otros, de cualquier modo hay una serie de enzimas que son muy útiles para el diagnóstico clínico y que son utilizadas como reactivos tanto en cuanto a la disponibilidad de enzimas puras a un precio razonable y las características particulares de su actividad catalítica han convertido a determinadas enzimas en reactivos de enorme valor para el laboratorio de análisis. De estas características cabe destacar dos que son de especial importancia: la alta velocidad de la catálisis enzimática, que permite la rápida determinación de muestras biológicas, y su especificidad, que facilita la detección y cuantificación de pequeñas concentraciones de un metabolito, un activador o un inhibidor en preparaciones crudas y condiciones suaves. Puede determinarse enzimáticamente la concentración de un compuesto en una mezcla cuando se dispone de una enzima especifica capaz de transformarlo rápidamente en un producto. En función de las características físicas de las molécula y de los sistemas de detección disponibles, se han establecido diversas metodologías, para cuantificar dicha transformación:

  • Ensayos con cambio total o punto final.
  • Ensayos cinéticos.
  • Ensayos catalíticos.
  • Inmunoensayo enzimático.

La última novedad en la analítica enzimática son las llamadas enzimas inmovilizadas que son enzimas ligadas químicamente a sustancias absorbentes. De todas maneras, todavía no se han aprovechado todas las ventajas y posibilidades que ofrecen las enzimas inmovilizadas, y es de prever que en el futuro adquieran una más amplia difusión e importancia como reactivos de gran utilidad en el análisis clínico, principalmente en los sistemas automáticos.

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